宏基因组（mNGS）简介（一）——临床领域的应用场景？什么是宏基因组

本文目录

• 宏基因组（mNGS）简介（一）——临床领域的应用场景
• 什么是宏基因组
• 宏基因组的介绍
• 宏基因组分析笔记之binning
• 宏基因组和宏病毒组的区别是什么
• 什么是宏基因组技术
• 宏基因组基础知识
• 宏基因组学的介绍
• “宏转录组”和“宏基因组 ”有什么区别
• 谁知道宏基因组三代测序的优缺点

宏基因组（mNGS）简介（一）——临床领域的应用场景

迄今为止，临床宏基因组学的应用场景包括以下几个方面：1、各种综合征和样本类型的传染病诊断 2、患病和健康状态下的微生物组特征分析 3、宿主转录学分析确定人类宿主对感染的反应特征 4、 肿瘤领域的应用包括鉴定肿瘤相关病毒及鉴定基因组整合位点。除传染病诊断外，mNGS其它领域的应用速度一直很慢，大多数应用尚未纳入常规临床实践。尽管如此，这些应用很可能在不久的将来改变诊断微生物学的领域。

分子诊断分析为诊断最常见的感染提供了一种快速经济有效的方法(通常小于2小时的周转时间)。然而，目前使用的几乎所有常规微生物试验一次只能检测一种或有限的病原体，或要求从临床样本中成功培养出微生物。与之相比，NGS的方法虽然耗费时间较长（在标准Illumina测序仪上需要耗费大于18个小时的时间），但是mNGS可以根据各个物种唯一的DNA或者RNA序列，一次性检测范围较广的病原菌，包括病毒、细菌、真菌或者寄生虫。 因此，NGS在诊断中的临床应用可能是在最难诊断的病例或免疫功能低下的患者中，在这些患者中潜在病原体的范围更大。最终，mNGS方法与其他多种检测方法相比更具成本竞争力，可以用作排除感染性病因的预先检测方法。当然，核酸类型的检测，无论是通过多重PCR 还是NGS，都不能单独证明一种是感染的病因，发现的结果必须在临床背景下进行解释。在临床样本中发现非典型或新型感染源时，需要进行后续的确认调查工作，例如组织活检样本的正交试验和血清试验，或者通过细胞培养以及动物模型的方法，以确定真正的致病菌。

图1 A 在传染病诊断方面的应用。包括从主要临床样本中直接鉴定微生物(Aa部分);基于耐药基因鉴定的抗菌药物耐药性预测(Ab部分)；检测种级或株级毒力决定因素，如分泌特定内毒素或外毒素(Ac部分);抗病毒药物耐药性预测(Ad部分)。如HIV-1所示，通过宏基因组下一代测序(mNGS)(部分Ad，图)从患者样本中恢复完整的病毒基因组有助于序列分析，以预测抗逆转录病毒药物的敏感性或耐药性(部分Ad，柱状图);分析菌株的易感谱(黑条)预测了对非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)类药物的耐药性(用星号表示)，而不是核苷逆转录酶抑制剂(NRTIs)或蛋白酶抑制剂(pi)

许多研究人员现在使用mNGS或16S rRNA基因靶向测序来深入描述微生物群落。越来越多的人意识到微生物组及其在急性和慢性疾病状态中的可能作用。 然而，基于微生物组的测试还没有被临床验证用于疾病的诊断或治疗，部分原因是由于对微生物组的复杂性及其在疾病发病机制中的作用的认识还不完全。 以下是临床微生物组分析的两个应用： 1、微生物组分析的一个未来临床应用可能是艰难梭菌相关疾病的管理和治疗。艰难梭菌是一种机会性细菌，可感染肠道，导致产生毒素，可导致腹泻、脱水、败血症和死亡。艰难梭菌感染只发生在受广谱抗生素或胃肠道手术等因素影响而改变的微生物组环境中。粪便移植在治疗可以治愈80% - 90%艰难梭菌感染中，这也证明了微生物组的重要性。在多项研究中使用mNGS来表征微生物组，促进了细菌-益生菌混合物的开发，这些混合物可作为预防或治疗艰难梭菌相关疾病的药片使用。 2、微生物组的另一个潜在应用是分析细菌多样性，这可以为患者的疾病是传染性还是非传染性提供线索。例如，一项用于鉴定肺炎患者呼吸道病原体的mNGS研究发现，经培养证实感染的个体其呼吸道微生物组的多样性明显较低。微生物组的改变，称为生态失调，它通常与肥胖、糖尿病、炎症性肠病等疾病相关，而微生物组的调控可能是治疗这些病理条件的途径。

图1 B 微生物组分析可以告知疾病、预后在急性和慢性疾病状态。彩色条代表微生物群的类别。生物失调(一种不健康的状态)可以看到物种多样性的减少，例如难辨梭菌相关疾病患者的情况。健康个体的粪便可以通过粪便移植或口服包囊粪丸来治疗艰难梭菌感染患者。另外，健康个体微生物群产生的合成粪便也可以作为益生菌用于治疗患者。除了艰难梭菌感染，慢性疾病，如肥胖，炎症性肠病和糖尿病是益生菌治疗的潜在靶点

临床mNGS主要关注微生物reads，然而RNA病毒检测的mNGS测序恰巧可以产生宿主RNA-seq分析数据，研究人类宿主感染时的基因表达对病菌感染具有补充作用。 尽管迄今为止没有任何基于RNA-seq的检测方法被临床验证用于患者，但RNA序列分析的潜在价值非常高。通过对微生物中具有转录活性的RNA序列分析，可以区分感染与定殖、活菌与死菌。此外，对人类宿主的RNAseq分析可用于直接从临床样本中识别新的或未得到充分重视的宿主微生物相互作用，正如莱姆病、登革热或疟疾患者中所显示的那样。RNA-seq分析可能在未来临床应用中具有特别重要的作用，因为真正起作用的病原菌在转录组中是短暂存在的。与血清学检测类似，感染的间接诊断也可能基于病原体特异性的人类宿主反应。。随着大规模测序数据的不断产生，或许是由常规临床mNGS检测驱动的，对人类reads的二次挖掘可能通过整合微生物和宿主基因表达数据提高临床诊断的准确性。

在肿瘤领域，全基因组测序或Panel捕获的NGS方法可用于同时发现与癌症相关的病毒(即疱疹病毒、乳头瘤病毒和多瘤病毒)或收集病毒与宿主相互作用的数据。例如，mNGS在发现默克尔细胞多瘤病毒(图1D)中起关键作用，默克尔细胞癌是一种最常见于老年患者的罕见皮肤癌，默克尔细胞多瘤病毒现在认为是默克尔细胞癌的原因。迄今为止，美国食品和药物管理局(FDA)已经批准了两种NGS Panel（MSK,Foundation One）检测基因突变。 通过在Panel上添加特定的病毒探针 ，可以对整个肿瘤基因组或外显子组进行测序时，顺便完成这些样本中整合病毒和外源性病毒的检测。

. Nature Reviews Genetics, 2019.

什么是宏基因组

2011年，当时我被分配到了老东家综合楼514室的医口业务线小RNA组混。 做小RNA测序服务业务的技术支持。 某日，办公室里，同事A不知哪根筋堵塞，突发灵魂一问：“到底什么是小RNA？怎么定义？” 同事B比较皮，答案脱口而出："就是很小的RNA呗！" 见此回答，大家一笑，也没把这个当回事，倒是有人看不下去了。 同事C：“这说法有点太不负责啊。小RNA一般包括miRNA、piRNA和siRNA三种RNA，这三种都是小RNA，咱公司小RNA测序针对的是18-40nt长度的小RNA，以miRNA为主。” 本着实事求是的心，那天晚上回去查了下相关资料。 小RNA的定义为：长度小于200nt的RNA，通常是非编码RNA。 发现同事B和C的回答都正确，但是都较为片面。不过，如果说这是一道价值2分的名词解释题的话，相较之下，同事B能得1分，同事C估计最多0.5分。 因为人家问的是小RNA是什么，人没问你小RNA包括哪几种，小RNA也不止这三种，而且小RNA的长度也说错了。 接下来问题来了，“根据同事B的推理方式，什么是宏基因组？” 可能会有人说：“宏基因组就是很’宏观‘的基因组啊！” 没错！太聪明了，一学就会啊。 不过呢，能给出这种回答的一般分两个极端，一种是什么也不知道瞎说，一种是真正理解此概念的洒家。 凡事向美好看齐，我姑且把上面的回答默认为是后者。 看似漫不经心，其实包藏玄机，但考试的时候这么回答注定是要得0分的。 可能这时候又有人会说：“宏基因组不是研究微生物群落的么？还宏什么？ 宏基因组在维基百科上的定义是环境样本中基因组的总和 。 由于宏基因组学主要针对的是微生物群落研究，所以这个概念现在主要指特定环境样本中的微生物基因组总和 （图1）。 进一步对”宏“这个字的理解，可参考古代圣贤王阳明12岁的时候作的一首诗，叫《蔽月山房》： 山近月远觉月小， 便道此山大于月。 若人有眼大于天， 当见山高月更阔。 王阳明12岁的时候，思绪就如此放荡不羁了，那么不妨效仿一下。 环境样本可大可小，如果你以一座城市、一个省、一个国家或者是整个地球作为环境样本呢？（注意：这里假设有外星人，不然地球就是总体，而不是抽样得来的样本了。） 是不是可以说这里面所有的生物的基因组都可以归为宏基因组的一部分？ 所有生物的基因组，岂不是包括人、马、牛、蟑螂、跳蚤、大肠杆菌……等的DNA。 很严格地根据定义，这也是宏基因组。 这样我们就很容易理解宏基因组的这个宏是什么意思了。 既然研究基因组的话，我们一个一个物种去测序就行了，为什么还会有宏基因组测序？ 这存在技术层面的原因，需要解释一下为什么现在认为的宏基因组学研究主要针对的是环境微生物样本，而不是针对城市、国家的所有生物这种样本。 研究城市里所有DNA？ 呃，……首先，难以操作不说，经费也是一个问题，而且城市里动植物与人的生态关系，多数我们肉眼可见，可以单独提取DNA去研究。 然而， 微生物之间的关系是肉眼不可见的，只能用实验的方式去了解，而且只有不到1%的微生物是可以分离培养，传统方法对微生物世界的认识主要集中于实验室纯培养的微生物物种，所以对微生物群落作为整体的认识远远落后于对其个体的研究。而宏基因组方法无须对微生物进行纯培养,从而可全面地对某一环境的微生物进行研究。 宏基因组就是宏观层面的基因组，这就没错了。只不过这些方法在现实中针对的是微生物。 既然叫宏，还有另一层意思。 就是说，宏基因组系列测序方法，可针对整个生物圈放眼量，小起指甲泥垢，中到瘤胃肠道（图2），大到山川河流，这些样本皆可收编测序。 作为豪放派湿人，此时我竟然情不自禁了，故做诗一首。 生物本无圈，奈何地球圆。 问君何所向？且看君划环。 上下十千米，纵横八万里。 耳鼻口肠胃，山海皆E 源。 这需要解释一下。 生物圈，地表生物有机体及其生存环境的总称。包括海平面以下深度约11千米、海平面以上10千米的范围。地球的周长，大约40000余公里（沿赤道），绕经线一圈大约39900多KM。毛泽东诗词有云：“坐地日行八万里，巡天遥看一千河。” E源，有两个意思，第一，我们带头大哥新创立的一个品牌叫E源基因，第二层意思，即所有来自Earth的样本。 布莱特杨 2019年3月24日

宏基因组的介绍

宏基因组 ( Metagenome)（也称微生物环境基因组 Microbial Environmental Genome, 或元基因组） 。是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词， 其定义为“the genomes of the total microbiota found in nature” , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因， 目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象， 以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段， 以微生物多样性、 种群结构、 进化关系、 功能活性、 相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。

宏基因组分析笔记之binning

一、宏基因组简介： reads→（根据overlap组装）→ contig重叠群 → （构建454 paired-end库或illumina meta-paired库，组装）→ scaffold → （binning）→ chromosome基因组草图 Contig N50：Reads拼接后会获得一些不同长度的Contigs.将所有的Contig长度相加,能获得一个Contig总长度.然后将所有的Contigs按照从长到短进行排序,如获得Contig 1,Contig 2,contig 3...………Contig 25.将Contig按照这个顺序依次相加,当相加的长度达到Contig总长度的一半时,最后一个加上的Contig长度即为Contig N50.举例：Contig 1+Contig 2+ Contig 3 +Contig 4=Contig总长度*1/2时,Contig 4的长度即为Contig N50.ContigN50可以作为基因组拼接的结果好坏的一个判断标准. Scaffold N50：Scaffold N50与Contig N50的定义类似.Contigs拼接组装获得一些不同长度的Scaffolds.将所有的Scaffold长度相加,能获得一个Scaffold总长度.然后将所有的Scaffolds按照从长到短进行排序,如获得Scaffold 1,Scaffold 2,Scaffold 3...………Scaffold 25.将Scaffold按照这个顺序依次相加,当相加的长度达到Scaffold总长度的一半时,最后一个加上的Scaffold长度即为Scaffold N50.举例：Scaffold 1+Scaffold 2+ Scaffold3 +Scaffold 4 +Scaffold 5=Scaffold总长度*1/2时,Scaffold 5的长度即为Scaffold N50.Scaffold N50可以作为基因组拼接的结果好坏的一个判断标准.二、binning简介： 宏基因组分箱（Binning）是将宏基因组测序得到的混合了不同生物的序列或序列组装得到的contigs按物种分开归类的过程。宏基因组分箱技术有助于获得不可培养微生物的全基因组序列，获得新物种的基因组序列和功能，预测未知物种的培养方法等等。 1，统计contig深度 第一列：contigName 第二列：contigLen 第三列：totalAvgDepth 第四列：library1.sorted.bam 第五列：library1.sorted.bam-var 第六列：library2.sorted.bam 第七列：library2.sorted.bam-var 2，用metaba参考： https://www.jianshu.com/p/117441ac6eb8

宏基因组和宏病毒组的区别是什么

①.宏基因组是研究所有微生物，病毒占比很少，在宏基因组中研究病毒组就像是大海捞针。宏病毒组的方法就像是用吸铁石，把宏基因组中病毒组部分吸出来，只看病毒就能避免宿主、细菌序列的影响。另外，宏病毒组分析流程和宏基因组有很大区别。②.病毒宏基因组测序又称宏病毒组，是在宏基因组学理论的基础上，结合现有的病毒分子生物学检测技术而兴起的一个新的学科分支。 宏病毒组直接以环境中所有病毒的遗传物质为研究对象，鉴定环境中的病毒组成， 是一种发现新病毒、 病毒感染预警和控制的手段， 在病毒的起源和进化模式、遗传多样性和地理分布等研究方面也具有重要意义。百度或微信搜索“基因帮”，获取更多文章咨询、行业进展以及病毒组相关技术。

什么是宏基因组技术

什么是宏基因组技术，宏基因组技术也称微生物环境基因组技术， 宏基因组即生境中全部微小生物遗传物质的总和，包含了可培养的和未可培养的微生物基因， 目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和，特定生物种基因组研究使人们的认识单元实现了从单一基因到基因集合的转变，宏基因组研究使人们摆脱物种界限，揭示更高层次的生命运动规律。

宏基因组基础知识

宏基因组学（Metagenomics）也称为元基因组学，是以样品中的微生物群落作为整体进行研究的学科。自然界中约有99%的微生物是不能在实验室条件下进行纯化培养的。宏基因组学研究不要求对每个微生物进行分离纯化培养，而是直接从样品中提取基因组DNA后进行测序分析。通过宏基因组测序，能够解释微生物群落多样性、种群结构、进化关系、功能活性及环境之间的相互协作关系，极大地扩展了微生物学研究范围。 目前宏基因组测序可以分为环境微生物多样性检测和宏基因组de novo测序。其中环境微生物多样性检测是指通过对环境中微生物16S rDNA高变区/ITS 的PCR扩增产物进行高通量测序，分析该环境下微生物群落的多样性和分布规律。宏基因组de novo测序是指对环境样品中所有微生物基因组DNA片段化后进行高通量测序，然后进行序列组装和基因注释，获得部分不可纯培养微生物的基因组序列，分析该环境下所有微生物基因集信息。 广义的metagenomics包括宏基因组测序和扩增子16S测序。16S测序相比宏基因组测序来说，价格更加便宜。利用16S技术对大量样本进行测序分析后，首先发现并阐明不同条件的样本间微生物组成以及多样性差异，然后挑选个别有代表性的样本，进行宏基因组测序，从而可以验证16S的分析结论、更加深入的阐明群落的功能情况，更好地说明微生物群落与环境之间的关系。可以简单的理解为，16S是指测了一部分的基因组的宏基因组。 宏基因组 ：宏基因组测序是指对微生物群体进行高通量测序（我的理解是因为很多情况下，微生物群落很难分离，所以只能一堆微生物一起拿来测序分析了），分析特定环境中微生物群体基因组成及功能、微生物群体的多样性与丰度，进而分析微生物与环境、微生物与宿主之间的关系，发现具有特定功能的基因。宏基因组测序无需分离纯培养微生物，较大扩展了微生物资源的利用，为环境微生物群落的研究提供了有效工具。宏基因组深度测序可以揭示或估计环境中真实的物种多样性和遗传多样性，挖掘具有应用价值的基因资源，应用于开发新的微生物活性物质。宏基因组研究分两个方向：扩增子测序和全基因组测序。 扩增子 ：扩增子（amplicon）为DNA或RNA扩增后的一段核苷酸序列。比如通过PCR扩增得到的某个基因的扩增片段。更简单的说，经过人工扩增的DNA片段或RNA片段、扩增产物。 扩增子测序 ，涉及特定序列位点的PCR扩增，通常是16S/18S rDNA。宏基因组的物种分类，一般用OUT（operational taxonomic unit），即可操作单元来表示。通常原生生物使用16S rDNA来衡量，真核生物的OUT使用18S rDNA来衡量。我的理解是，选取一段特别的DNA片段来测序，这段DNA还可以区分不同的菌落 为什么用16S，而不是其他15S或者17S呢 16SrRNA 为核糖体的RNA的一个亚基，16SrDNA就是编码该亚基的基因。细菌rRNA（核糖体RNA）按 沉降系数 分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码 rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中。16SrDNA是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大（约占细菌RNA含量的80%），分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。在大多数原核生物中rDNA都具有多个拷贝，5S、16S、23S rDNA的拷贝数相同。16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。 沉降系数 ：沉降系数（sedimentation coefficient）用离心法时，大分子沉降速度的量度，等于每单位离心场的速度。或s=v/(ω^2*r)。s是沉降系数，ω是离心转子的角速度（弧度/秒），r是到旋转中心的距离，v是沉降速度。沉降系数以每单位重力的沉降时间表示，并且通常为1～200×10的-13次方秒范围，10的-13次方这个因子叫做沉降单位s，即1s=10^-13秒，沉降系数对于生物大分子来说，多数在(1~500)×10^-13秒之间，如血红蛋白的沉降系数约为4×10的-13次方秒或4s。

宏基因组学的介绍

宏基因组学（Metagenomics）又叫微生物环境基因组学、元基因组学。它通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA,构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能。它是在微生物基因组学的基础上发展起来的一种研究微生物多样性、开发新的生理活性物质（或获得新基因）的新理念和新方法。其主要含义是： 对特定环境中全部微生物的总DNA（也称宏基因组，metagenomic）进行克隆，并通过构建宏基因组文库和筛选等手段获得新的生理活性物质；或者根据rDNA数据库设计引物，通过系统学分析获得该环境中微生物的遗传多样性和分子生态学信息。

“宏转录组”和“宏基因组 ”有什么区别

“宏转录组”和“宏基因组 ”的区别是：基因组一般指的是DNA（某些只含有RNA的生物除外），而转录组则指的是RNA。

基因组，Genome，一般的定义是单倍体细胞中的全套染色体为一个基因组，或是单倍体细胞中的全部基因为一个基因组。可是基因组测序的结果发现基因编码序列只占整个基因组序列的很小一部分。因此，基因组应该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子。说的更确切些，核基因组是单倍体细胞核内的全部 DNA分子；线粒体基因组则是一个线粒体所包含的全部DNA分子；叶绿体基因组则是一个叶绿体所包含的全部DNA分子。

详细内容：

《遗传学名词》第二版对“基因组”的释义：

单倍体细胞核、细胞器或病毒粒子所含的全部DNA分子或RNA分子。

现代遗传学家认为，基因是DNA(脱氧核糖核酸)分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。基因位于染色体上，并在染色体上呈线性排列。基因不仅可以通过复制把遗传信息传递给下一代，还可以使遗传信息得到表达。不同人种之间头发、肤色、眼睛、鼻子等不同，是基因差异所致。

基因是生命遗传的基本单位，由30亿个碱基对组成的人类基因组，蕴藏着生命的奥秘。始于1990年的国际人类基因组计划，被誉为生命科学的“登月”计划，原计划于2005年完成。各国所承担工作比例约为美国54%，英国33%，日本7%，法国2.8%，德国2.2%，中国1%。此前，人类基因组“工作框架图”已于2000年6月完成，科学家发现人类基因数目约为2.5万个，远少于原先10万个基因的估计。

人类基因组是全人类的共同财富。国内外专家普遍认为，基因组序列图首次在分子层面上为人类提供了一份生命“说明书”，不仅奠定了人类认识自我的基石，推动了生命与医学科学的革命性进展，而且为全人类的健康带来了福音。

转录组（transcriptome）广义上指某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集合，包括信使RNA、核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA；狭义上指所有mRNA的集合。

参考资料

百度百科：https://baike.baidu.com/item/基因组/2746983?fr=aladdin

谁知道宏基因组三代测序的优缺点

①.一代测序优势：1. 第一代测序技术的准确性远高于二、三代测序，因此被称为测序行业的“金标准”；2. 第一代测序每个反应可以得到700-1000bp的序列，序列长度高于二代测序；3. 第一代测序价格低廉，设备运行时间短，适用于低通量的快速研究项目。劣势：1. 第一代测序技术一个反应只能得到一条序列，因此测序通量很低；2. 第一代测序技术虽然单个反应价格低廉，但是获得大量序列的成本很高。②.二代测序优点：1. 一次能够同时得到大量的序列数据，相比于一代测序技术，通量提高了成千上万倍；2. 单条序列成本非常低廉。缺点：1. 序列读长较短，Illumina平台最长为250-300bp，454平台也只有500bp左右；2.由于建库中利用了PCR富集序列，因此有一些含量较少的序列可能无法被大量扩增，造成一些信息的丢失，且PCR过程中有一定概率会引入错配碱基③.三代测序优点：1. 无需PCR扩增，不会人为的引入突变；2. 超长读长，平均读长可达到10Kb，最长读长可以达到40Kb；3. 覆盖均匀，无GC偏好性；4. 通过reads的自我矫正，10X以上准确率能够达到99.9%；5. 可以直接检测到甲基化信息，同步进行表观遗传学识别。缺点：1. 单条序列错误率较高，平均核苷酸准确性不到85%；2. 测序成本较贵。想了解更多前沿咨询、行业进展以及病毒组相关知识，可以微信或百度搜索“基因帮”。